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| 用途

 

           研究 Rac1 ,RhoA,和 Cdc42 信號(hào)通路之間的細(xì)胞型特異性串?dāng)_。

           研究Rho 家族 小G 蛋白激活 對(duì)其他信號(hào)通路的影響。

           體內(nèi) Rac1/RhoA/Cdc42 激活水平的分析。

           檢測增強(qiáng) Rac1/RhoA/Cdc42 活性的化合物和蛋白質(zhì)。

           檢測抑制 Rac1/RhoA/Cdc42 活性的化合物和蛋白質(zhì)。

           對(duì)細(xì)胞(組織) 中的Rac1/RhoA/Cdc42  的活性進(jìn)行定位,定量,定性分析。

 

 

 

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| 產(chǎn)品說明

 

      小G蛋白家族中最重要的是Rho家族蛋白種的Rac1、RhoA和Cdc42,這三種蛋白相互協(xié)調(diào)、相互依賴,共同調(diào)節(jié)骨架蛋白的結(jié)構(gòu)重組和形成RhoA/Rac1/Cdc42的作用相反,Rac1/Cdc42對(duì)神經(jīng)元的發(fā)生、遷移、生長、維持等起到促進(jìn)作用,而RhoA對(duì)神經(jīng)元的形成和維持起到抑制作用。體內(nèi)Rho有兩種形式,即GDP結(jié)合的無活性狀態(tài)與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)。并且,通過體內(nèi)三類蛋白,即鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(guaninenucleotide exchange factor,GEF)、GTPase激活因子(GTPase activating protein,GAP)與鳥甘酸解離抑制子(guanine nucleotide dissociation inhibitor,GDI),有序地調(diào)控Rho蛋白活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。它還參與許多生理活動(dòng)，包括細(xì)胞遷移、粘附、胞質(zhì)分裂、增殖、分化和凋亡，并在更大程度上參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

    

     在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞中，Cdc42,Rho,Rac在信號(hào)傳導(dǎo)的過程中起著重要的作用。學(xué)習(xí)他們之間的串?dāng)_和互相之間的反饋對(duì)研究他們之間的相互反應(yīng)可以提出很多不錯(cuò)的建議。同時(shí)，對(duì)Rho蛋白家族的時(shí)空動(dòng)力學(xué)的觀測可以為空間極性和Cdc42/Rac和Rho提供證據(jù)。而武漢紐萊生物科技有限公司推出的 Rac1/RhoA/Cdc42 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠異性 的識(shí)別特殊構(gòu)象的 GTP 結(jié)合蛋白，而不識(shí)別 GDP 結(jié)合蛋白，進(jìn)而快速的進(jìn)行 Rac1 / RhoA/Cdc42 活性檢測。每個(gè)試劑盒可以對(duì)Rac1/RhoA/Cdc42 各進(jìn)行10次免疫親和沉淀。同時(shí)試劑盒中的Rac 1/RhoA/Cdc42 識(shí)別GTP 空間構(gòu)象的單克隆抗體也可以通過免疫組化和免疫熒光對(duì)細(xì)胞（組織中）的Rac1/RhoA/Cdc42 的活性進(jìn)行監(jiān)測。

 

 

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| 檢測原理

 

         武漢紐萊生物科技有限公司的 Rac1/RhoA/Cdc42 活性檢測試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異構(gòu)象的GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的(樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理)活性 蛋白的GTP 的水平。簡言之，特異性識(shí)別活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再分別利用識(shí)別 Rac1/RhoA /Cdc42的兔多克隆 抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測。

 

 

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| 試劑盒組份及儲(chǔ)存

          

名稱	貨號(hào)	規(guī)格	儲(chǔ)存溫度
Anti-active Rac1 mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23001	1x12ul	-20℃
Anti-active RhoA mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23002	1x12ul	4℃
Anti-active Cdc42 mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23003	1x12ul	4℃
Anti-Rac1 Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24001	1x20ul	-20℃
Anti-RhoA Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24002	1x20ul	-20℃
Anti-Cdc42 Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24003	1x20ul	-20℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#NL29002	1x50ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#NL30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lysis Buffer	Cat.#NL30303	1x30ml	4℃
100xGTP-rS	Cat.#NL30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#NL30304	1x50ul	-80℃

 

注意:使用前應(yīng)將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。 

 

試劑盒所需自備物品。

 

1.刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

試劑盒注意事項(xiàng)

 

1.收到試劑盒后如不立即使用，請(qǐng)將試劑盒組分按照標(biāo)簽說明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度，100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。 

2.Protein A/G Agarose使用前請(qǐng)稍微離心甩一下，因管壁上可能殘留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇揮發(fā)，體積較少時(shí)很難將Agarose吹散，所以請(qǐng)補(bǔ)充20%乙醇等于Agarose的體積。

3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用槍將其吹勻，一個(gè)反應(yīng)管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足夠。

4. 將50% 的Protein A/G Agarose加入反應(yīng)管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗滌3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合適體積的1×Assay/Lysis Buffer懸浮Agarose，再分裝于 反應(yīng)管，保證每管參與反應(yīng)的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 為了減少50% 的Protein A/G Agarose的損失，可以先在反應(yīng)管中加入適當(dāng)體積的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反應(yīng)管中試劑加入順序建議，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀釋的Protein A/G Agarose，細(xì)胞裂解液和活性抗體，總體積建議0.5ml-1ml

7. 活性抗體的加入量請(qǐng)適當(dāng)做調(diào)整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反應(yīng)在4℃ 360度搖床進(jìn)行。

9. 反應(yīng)完畢，洗滌Agarose時(shí)候，盡量避免吸走Agarose。

 

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| 實(shí)驗(yàn)操作步驟

 

A    試劑制備

 

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B    樣品處理

 

        貼壁細(xì)胞

 

1.培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理. 

2.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3.向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4.將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5.用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6.將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9.收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

        懸浮細(xì)胞

 

1.培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2.計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4.向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5.反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6.將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對(duì)照(可選）

 

注意： 在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 Rac1/RhoA/Cdc42 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Rac1/RhoA/Cdc42 被激活。

1. 準(zhǔn)備六個(gè)離心管,并標(biāo)記 #1- #6，#1 #2 兩個(gè)管中各加入 0.5 mL 包含目的蛋白R(shí)ac1的細(xì)胞提取物或者1ug Rac1純蛋白, #3,#4 兩個(gè)管中各加入 0.5 mL 包含目的蛋白R(shí)hoA的細(xì)胞提取物或者1ug RhoA 純蛋白。 #5, #6 兩個(gè)管中各加入 0.5 mL 包含目的蛋白Cdc42的細(xì)胞提取物或者1ug cdc42 純蛋白。

2.  每個(gè)管中加入20ul 0.5M EDTA (終濃度即為 20 mM)。

3. #1,#3,#6 管中加入 5ul 的 100X GTPγS (終濃度即為 100 uM)作為陽性對(duì)照。#2,#4,#5 管中加入 5ul 的 100X GDP (終濃度即為 1 mM)作為陰性對(duì)照。

4.  將六個(gè)離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將六個(gè)離心管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2 (終濃度即為 60mM

 

D.激活 Rac1 /RhoA /Cdc42 的親和沉淀

 

1. 準(zhǔn)備三個(gè)離心管并標(biāo)記 #7- #9 , #7 管中加入 0.5-1ml 包含目的蛋白 Rac1 的細(xì)胞提取物，#8 管中加入 0.5-1ml 包含目的蛋白 RhoA 的細(xì)胞提取物. #9 管中加入0.5-1ml 包含目的蛋白cdc42 的細(xì)胞提取物。

2. 用 1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個(gè)管中的體積調(diào)整到1ml

3.  向#7-#9 三管中依次加入1ul 活性的 Rac1  (NL23001)  RhoA (NL23002)  Cdc42（NL23003）的單克隆抗體

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入#7-#9 三個(gè)離心管

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時(shí)，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

 

1.取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干，注意：如果使用的是硝化纖維素膜，此步省略

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時(shí)進(jìn)行封閉，并需要 恒定振蕩。

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7.孵育一抗：在孵育一抗前，應(yīng)把膜裁剪成三份（以區(qū)分 #7 #8  #9）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3% BSA 稀釋兔多抗（NL24001，NL24002，NL24003) 按照（1：1000，稀釋）分開進(jìn)行孵育。 4°C  孵育一個(gè)小時(shí)，或者過夜。

8. 用 TBST 緩沖液洗滌三次 / 膜 / 5min。

9.  孵育二抗：(例如羊抗兔 IgG-HRP)用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀 釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌三次 / 膜 /5min。

11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

 

 Rac1 激活示列結(jié)果

 

 

          

                    

 

 RhoA 激活示列結(jié)果                

        

 

    

             

                  

 

 

Cdc42  激活示列結(jié)果

 

                  

               

 

 

 

 

                                      

                                       與傳統(tǒng)的 GST- pull down 方法相比，該試劑盒具有以下明顯優(yōu)勢

 

 

1.靈敏度高；誘導(dǎo)蛋白與目標(biāo)蛋白中的結(jié)合對(duì)蛋白量的要求比較高。而抗體與蛋白的結(jié)合對(duì)樣本中蛋白的要求比較少。

2. 特異性強(qiáng)；因?yàn)檎T餌蛋白是需要加上GST標(biāo)簽的重組蛋白，所以是非生理狀態(tài)下的驗(yàn)證，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形式可能與天然狀態(tài)下存在一定差異，而抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合 ，活細(xì)胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)之間的相互作用被保持，所以其反映的是細(xì)胞中真實(shí)的蛋白情況.

3. 應(yīng)用更為廣泛；試劑盒中能夠特異性識(shí)別GTP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，適應(yīng)各種種屬（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）應(yīng)用范圍非常廣泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）隨著這些應(yīng)用的普及，G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進(jìn)展，必將進(jìn)一步加快。